材料与方法
1.1 主要材料与药品 手动组织研磨玻璃匀浆器(上海酶联生物科技有限公司),离心机(北京白洋医疗器械有限公司),家兔心肌纤维 Masson染色试剂盒(上海酶联生物科技有限公司),重组人 RLX(ProSecTanp-yTechnoGeneLtd.公司 ),乌拉坦(上海伊卡生物技术有限公司,批号:20130609),青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司,批号:015380),3-硝基酪氨酸(3-NT)、RLX、NO、cGMP、PKG检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 选取健康成年新西兰家兔 28只,体质量(2.05±0.19)kg,雌雄不限,购于宁波大学动物实验中心[许可证号:SCXK(浙)20120005]。随机分为假手术组6只,DHF组6只、RLX小剂量组8只,RLX大剂量组8只。
1.2.2 建立 DHF模型及给药 参见文献[5]建立
DHF模型。手术严格无菌操作,每只家兔术后给予30万 U/(kg·d)青霉素肌肉注射3d,预防感染,术后精心饲养。术后第8周开始,使用微升注射器,经家兔耳缘静脉注射 RLX,RLX 小剂量组为30μg/(kg·d),ROX大剂量组为 98μg/(kg·d),给药时间2周。剂量标准参见文献[6],三期临床试验表明,急性心力衰竭患者 RLX最佳剂量为30 /(k · μg g
d),再根据徐淑云教授主编的 《药理实验方法学》换算出家兔等效给药剂量为 98μg/(kg·d)。DHF组和假手术组不做任何处理,标准饲料饲养以做空白对照。
1.2.3 血清钠尿肽和 RLX测定及心肌匀浆指标测定 术后10周给药结束,对各组家兔经耳缘静脉抽血、离心后取上清液-20 备检,采用ELISA 法检测各组家兔钠尿肽、RLX;采用空气栓塞法处死各组加兔,迅速开胸取出心脏,快速置于装有预冷的生理盐水杯内充分洗净血液,滤纸吸干称重,去除心包、心房、右心室及脂肪组织等,切取部分左心室后壁称重,其余部分留作病理染色切片,按1 9的体
质量体积比加入预冷的PBS缓冲液(H7.4),在冰浴中充分研磨制成10%匀浆液,3000r/min离心20min,取0.4ml上清液 -20 备检。待标本收集完毕后,采用 ELISA 法检测各组家兔10%心肌匀浆上清液3-NT,NO、cGMP、PKG 活性。检测方法严格按照试剂说明书。
1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件,计量资料用 表示,采用单因素方差分析,
x±s P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 假手术组与 DHF组血清 RLX水平比较 与假手术组比较,DHF组血清RLX水平明显升高,差
异有统计学意义[(466.32±6.52)/mlvs(222.4±pg
5.29)pg/ml,P<0.05]。
2.2 4组血清钠尿肽水平比较 与假手术组比较,DHF组、RLX小剂量组、RLX大剂量组血清钠尿肽水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与DHF组比较,RLX 大剂量组血清钠尿肽水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),RLX小剂量组血清钠尿肽水平有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05,表1)。
2.3 4组心肌匀浆指标比较 与假手术组比较,
DHF组、RLX小剂量组、RLX大剂量组心肌匀浆3-NT水平明显升高,NO、cGMP、PKG活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与 DHF 组比较,RLX大剂量组心肌匀浆中 NO、cGMP、PKG 活性明显升高,3-NT水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),RLX 小剂量组 NO、cGMP、PKG 活性轻微升高,3-NT有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05,表1)。
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本实验尚存在不足之处:(1)实验动物数量偏少,可能导致一些数据波动、误差可能。
(2)选取的家兔雌雄不限,雌雄家兔的基础 RLX 水平不同,可能会影响实验的结果。
(3) 在后续实验中,我们将对此补充改进,以获得更有意义的结论。