1、ELISA试剂盒的预备

按ELISA试剂盒说明书的请求预备试验中需用的试剂。ELISA顶用的蒸馏水或去离子水，包含用于洗刷的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液运用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后运用。试剂盒中本次试验不需用的有些应及时放回冰箱保存。

2、保温

在ELISA中通常有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶物后。抗原抗体反响的完结需求有必定的温度和时刻，这一保温进程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的只在固相表面上发作。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其间的抗原并不是都有平等的和固相抗的时机，只需zui靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体触摸。这是一个逐渐平衡的进程，因而需经扩散才干到达反响的结尾。在这以后参加的酶符号抗体与固相抗原的也相同如此。这即是为何ELISA反响老是需求必定时刻的温育。

温育常选用的温度有43℃、37℃、室温文4℃（冰箱温度）等。37℃是试验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体的适宜温度。ELISA试剂盒在树立ELISA办法作反响动力学研究时，试验标明，两次抗原抗体反响通常在37℃经1-2小时，产品的生成可达。为加快反响，可进步反响的温度，有些试验在43℃进行，但不宜选用更高的温度。抗原抗体反响4℃更为完全，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中夜，以构成zui多的沉积。但因所需时刻太长，在ELISA中通常不予选用。

保温的方法除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，通常均选用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度敏捷平衡。为防止蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反响板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的资料如金属等，在盒底垫湿的纱布，zui后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规则的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反响板均不宜叠放，以保证各板的温度都能敏捷平衡。室温温育的反响，操作时的室温应严厉约束在规则的范围内，规范室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的请求操控温育。室温温育时，ELISA板只需平置于操作台上即可。应留意温育的温度和时刻应按规则力求。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

ELISA试剂盒运用留意事项

1、试剂蜕变的痕迹发色试剂有任何色彩标明发色剂蜕变，应当弃之。0规范的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)时，表示试剂也许蜕变。

2、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20～25℃)会导致一切规范的OD值偏低。

3、在洗板进程中假如呈现板孔干燥的状况，则会呈现规范曲线不成线性，重复性欠好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

4、每加一种试剂前需将其摇匀。

5、在参加底物液A液和底物液B液后，通常显色时刻为15～20min即可。若色彩较浅，可延长反响时刻到30min。反之，则减短反响时刻。

6、反响停止液为2M硫酸，防止触摸肌肤。

7、不要运用过了有用日期的ELISA试剂盒;也不要运用过了有用期的试剂盒中的任何试剂，掺杂运用过了有用期的ELISA检查试剂盒会引起活络度的下降;不要交换运用不一样批号试剂盒中的试剂。

当然除了留意以上几点外，选对ELISA试剂盒也很关键，可以大大下降试验危险性。