ELISA法是20世纪70年代初由荷兰学者VanWeeman和Schurrs与瑞典学者Engvall和Perlman几乎同时提出的。最初，ELISA主要用于病毒、细菌的检测。20世纪70年代末，开始广泛应用于抗原、抗体的定性和定量测定，包括一些药物、激素、毒素等半抗原分子的定量检测。由于ELISA检测对仪器要求程度低，操作简便，特别是对样品前处理要求简单，易于推广，且具有准确、灵敏、快速、特异、经济等优点，日益成为许多领域分析技术研究的重点。
ELISA原理
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗原抗体特异性反应的常用免疫学检测方法。其核心原理是将抗原或抗体结合到固相载体上，并利用酶标记的抗原或抗体进行检测。固相载体上的抗原或抗体保留其免疫活性，而酶标记的抗原或抗体则同时保留免疫活性和酶的活性。
ELISA有多种类型，包括夹心法、竞争法和间接法等，各有不同的操作步骤。以夹心法为例，首先将特异性抗体包被于固相载体，然后加入待测样品，使其中的抗原与包被抗体结合。洗涤去除未结合的物质后，加入酶标记的二抗，该二抗与结合在固相载体上的抗原特异性结合。再次洗涤去除未结合的酶标记二抗后，加入相应的酶底物。底物在酶的催化下发生反应，生成可检测的有色产物。产物的量与待测抗原的量成正比。通过酶标仪测定反应产物的吸光度值，并与预先建立的标准曲线进行比较，即可定量测定样品中待测抗原的浓度。
其他类型的ELISA，例如竞争法和间接法，则采用不同的策略，但都利用了抗原抗体反应的特异性和酶的催化放大作用，实现对目标物质的定性或定量检测。由于酶的高催化效率，ELISA具有很高的灵敏度。
ELISA实验技巧
加样
ELISA实验中，加样是至关重要的操作步骤，贯穿于整个实验过程，包括加样品、加试剂、加洗涤液等。准确和一致的加样是保证实验结果可靠性的关键。
目前ELISA实验中主要使用多道移液器进行加样，可以同时给多个孔加样，提高效率并保证加样一致性。对于少量样品或标准品，可以使用单道移液器。选择合适的移液器规格至关重要，以确保加样体积的准确性。
正确的加样手法如下：将移液器枪头贴近孔底，但不要接触孔底，缓慢且平稳地排出液体，避免产生气泡。加样后稍微抬起枪头，再离开孔，以免吸回液体。避免将液体加到孔壁上，并确保所有试剂都加到孔底。每次加样后，应更换枪头，防止交叉污染。
洗涤步骤也需要正确的加样操作。使用洗涤液冲洗整个孔壁，并保证足够的浸泡时间，以充分去除未结合的物质。
在加样前，需要充分混匀试剂，确保试剂浓度均匀。某些步骤之后，例如加酶标记物后，需要轻轻拍打酶标板，以促进反应。
显色步骤对时间的要求较高。使用多道移液器可以快速完成加液过程，尽量减少不同孔之间加样时间的差异。更重要的是，要确保所有孔的反应起始时间一致，以减少误差。
稀释
ELISA实验中，包被抗原、样本、抗体、酶标二抗等通常需要进行稀释。准确的稀释对实验结果的可靠性至关重要。
稀释倍数的确定需要根据具体的实验要求、试剂盒说明书以及样本的浓度来确定。通常需要进行预实验，以找到最佳的稀释倍数。
稀释时，应使用经过校准的移液器，并根据所需的体积选择合适的规格。将需要稀释的物质（如样本、抗体等）加入到装有适量稀释液的试管或EP管中，而不是先加稀释液到板孔中。使用移液器反复吹打或涡旋振荡器使样本与稀释液充分混匀。对于需要进行系列稀释的情况，应该采用逐步稀释的方法，以减少误差。例如，如果需要将样本稀释100倍，可以先稀释10倍，再从10倍稀释液中取一部分稀释10倍，最终达到100倍稀释。
在整个稀释过程中，应注意避免交叉污染。例如，每次吸取不同浓度的溶液时，都应更换移液器枪头。此外，还应根据试剂盒说明书选择合适的稀释液。
洗涤
在ELISA过程中，洗涤步骤虽然不直接参与反应，但对实验结果的准确性和可靠性至关重要。洗涤的目的是去除未与固相抗原或抗体结合的游离酶标记物，以及非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料材料对蛋白质具有非特异性吸附作用，这些吸附的干扰物质必须通过洗涤步骤去除。
洗涤操作必须严格按照试剂盒说明书的要求进行。通常情况下，洗涤步骤需要重复多次，一般为3-5次。每次洗涤时，应确保洗涤液充满每个孔，并浸泡一定时间，通常为30秒到1分钟。然后将酶标板倒扣在干净、无尘的吸水纸上，轻拍板底，吸干孔内残留的洗涤液，避免用力过猛导致孔内物质溅出。残留的洗涤液会稀释后续加入的试剂，影响最终结果的准确性。
常用的洗涤方法包括：手动浸泡式洗涤、流水冲洗式洗涤和自动洗板机洗涤。无论采用哪种方法，都应确保洗涤充分且一致。洗涤液的配制也应严格按照试剂盒说明书的要求进行，并使用新鲜配制的洗涤液。
正确的洗涤操作可以最大限度地减少背景信号，提高信噪比，从而保证ELISA结果的准确性和可靠性。
显色
显色是ELISA的最后一步，通过酶催化底物生成有色产物来实现信号检测。不同的酶需要使用不同的底物，例如辣根过氧化物酶（HRP）常用的底物有TMB、OPD等，碱性磷酸酶（AP）常用的底物有PNPP等。
反应温度和时间是影响显色的重要因素。在一定范围内，升高温度可以加快显色速度。然而，温度过高或时间过长都可能导致非特异性显色或底物耗尽，影响结果的准确性。因此，需要根据具体的试剂盒和实验条件优化反应温度和时间，以获得最佳的信噪比。
定量ELISA中，为了确保结果的准确性，需要在规定的时间点加入终止液来终止酶促反应。然后使用酶标仪在特定波长下读取吸光度值。
定性ELISA的显色通常在室温下进行。虽然时间不必像定量ELISA那样严格控制，但也需要根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况，以及预先设定的判断标准来判断结果。例如，阳性孔的吸光度值应达到阴性孔吸光度值的特定倍数以上，才能判定为阳性。
除了阳性和阴性对照，ELISA实验还应设置空白对照，用于扣除背景信号，提高检测的准确性。
比色
ELISA比色前，需要进行一些准备工作，以确保测量结果的准确性。
首先，用干净、无尘的吸水纸或专用擦拭布轻轻擦拭酶标板底部，去除残留的液体、指纹和污渍。避免用力擦拭，以免划伤板底，影响读数。确保酶标板清洁且干燥。
然后，将酶标板按照正确的方向放入酶标仪的比色架上，确保与酶标仪的光路匹配。
酶标仪应放置在避光环境中，操作室温度应控制在15～30℃。使用前，应根据酶标仪的型号和使用环境，预热酶标仪至指定时间，以使结果更加稳定。并根据需要对酶标仪进行校准，包括定期校准和空白校准。
最后，根据所用底物选择正确的检测波长，并根据实验需求选择合适的读数模式（例如：单波长、双波长等）。设置好参数后，即可开始读取吸光度值。
上述是ELISA的基本原理及技巧。从抗原抗体的特异性结合到酶催化底物显色，每一个步骤都环环相扣，影响着最终结果的准确性。只有深入理解ELISA的原理，并严格按照操作规范进行实验，才能获得可靠的实验数据。
