甲硝唑检测试剂盒使用说明书
（酶联免疫法）
1 原理及用途
本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法检测组织、蜂蜜等样本中的甲硝唑（Metronidazole，MNZ），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的甲硝唑和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗甲硝唑抗体，加入酶标记物后，用 TMB 底物显色，样本吸光度值与其所含甲硝唑含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中甲硝唑的残留量。
2 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反应模式：25℃ 30min～30min～15min
2.3 检测下限：
组 织（鸡、鸭肉/肝脏、鱼、虾、等）…………0.25ppb
蜂蜜 ………………………………………………0.25ppb
2.4 交叉反应率：
与类似物的交叉反应率：
甲硝唑(MNZ) ………………………………………100%
二甲硝咪唑 DMZ……………………………………68%
2.5 样本回收率：
鱼/虾/禽/肝脏………………………………90±10%
蜂蜜样本 ……………………………………90±10%
3 试剂盒组成
酶标板 1 块，96 孔/板标准
液 6 瓶（黑盖）：1ml/瓶
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb 高标准液 100 ppb ………………………………1ml
抗体工作液 (蓝盖)………………………………5.5ml
酶标记物 (红盖)…………………………………11ml
底物液 A (白盖)……………………………………6ml
底物液 B(黑盖) ……………………………………6ml
终止液(黄盖) ………………………………………6ml
20X 浓缩洗涤液(白盖)……………………………40 ml
2X 浓缩复溶液(黄盖)…………………………… 50 ml 说
明书………………………………………………1 份
4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒温箱
4.2 微量移液器：单道 20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 300µl
4.3 试剂：NaOH、无水碳酸钠、碳酸氢钠、正己烷、乙酸乙酯 4 需要的器材和试剂 4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡 器、离心机、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒温箱 4.2 微量移液器：单道 20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 300µl 4.3 试剂：NaOH、无水碳酸钠、碳酸氢钠、正己烷、乙酸乙 酯
2）加入 9ml 乙酸乙酯，振荡 5 分钟，室温 4000 转/分，离心5 分钟；
3）取上层有机相 6ml 至另一离心管中，加入 2ml 乙酸乙酯，2ml 2M 氢氧化钠溶液，振荡 5 分钟，室温 4000 转/分，离心 5 分钟；
4）取 4ml 清澈上层有机相至干净玻璃试管中，30～40℃氮气或空气吹干；
5）加入正己烷 1ml，涡动 30s，再加入 0.5ml 复溶液混合 30秒，室温 4000 转/分以上，离心 5 分钟；
6）去除上层有机相，取下层 50µl 液体用于分析。稀释倍数 0.5 检测下限 0.25ppb
5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
配液 1：0.1M 碳酸盐缓冲液称取 4.66g 无水碳酸钠，0.5g 碳酸氢钠去离子水 500ml 溶解，pH 10.6 。
配液 2：2M 氢氧化钠溶液 称取 40g 氢氧化钠，加入去离子水 500ml 溶解。
配液 3：洗涤液将浓缩洗涤液 20 倍稀释(1 份洗涤液加 19 份去离子水)。
配液 4：复溶液将2×复溶液用去离子水 2 倍稀释（1 份复溶液加 1 份去离子水）,用于样本的复溶，复溶液在 4℃环境可保存一个月。
5.3 样本前处理步骤：
5.3.1 组 织（鸡、鸭肉/肝脏、鱼、虾、等）、蜂蜜 1）取 3g样本，加 3ml 0.1M 碳酸盐缓冲溶液振荡至蜂蜜全部
2）加入 9ml 乙酸乙酯，振荡 5 分钟，室温 4000 转/分，离心5 分钟；
3）取上层有机相 6ml 至另一离心管中，加入 2ml 乙酸乙酯，2ml 2M 氢氧化钠溶液，振荡 5 分钟，室温 4000 转/分，离心 5 分钟；
4）取 4ml 清澈上层有机相至干净玻璃试管中，30～40℃氮气或空气吹干；
5）加入正己烷 1ml，涡动 30s，再加入 0.5ml 复溶液混合 30秒，室温 4000 转/分以上，离心 5 分钟；
6）去除上层有机相，取下层 50µl 液体用于分析。稀释倍数 0.5 检测下限 0.25ppb
6 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从 4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。
6.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品或样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液 50µl/孔，轻轻振荡 5 秒混匀，25℃避光反应30分钟。
6.3 洗 涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液 250µl/孔充分洗涤 5 次，每次间隔 30 秒，最后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 加酶反应：加酶标记物 100µl/孔，25℃避光反应 30 分钟。
6.5 洗涤：同上
6.6 显 色：加底物液 A 50µl/孔，再加底物液 B 50µl/孔，轻轻振荡 5 秒混匀，25℃避光显色 15 分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。
6.7 终止：每孔加入终止液 50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.8 测吸光值：用酶标仪于 450nm 处测定每孔吸光度值（建议用双波长 450/630nm）。测定应在终止反应后 10 分钟内完成。
7 结果分析
7.1 百分吸光率的计算
标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸
光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度 值，再乘以 100%，即
| 百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
| A0 |
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb 标准溶液的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
8 注意事项
8.1 室温低于 25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0 标准的吸光度值小于 0.5 个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。
9 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于 2-8℃保存，避免冷冻。
保 质 期：该产品有效期为 1 年，生产日期见包装盒。
