Rat VEZCadherin/CD144 ELISA Kit用途：
该试剂盒适用于检测体外血清、血浆或其他相关生物液体，对检测的样品进行定性/相对定量的统计分析。
基本性能：
性 能：
灵敏度： 12.5pg/ml
特异性： 不与其它可溶性结构类似物交叉反应
重复性： 板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15%
检测范围：62.5→4000pg/ml
检测原理：
本试剂盒采用双抗体夹心SP-ELISA方法:将特异性的捕获抗体包被于高亲和力的酶标板上，酶标板中对应加入标准品及待测样品，样品及标准品中的靶蛋白被捕获，生物素化的检测抗体与靶蛋白结合， SP复合物与生物素化检测抗体结合，形成免疫复合物，检测过程中每一步经过洗涤液的彻底洗涤，游离的成分均被洗去，用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的作用下，若反应孔中有靶蛋白则显蓝色，加入终止液后变黄色，用酶标仪在450 nm处测OD值，靶蛋白浓度与OD值之间呈正比，根据OD值绘制标准曲线计算出样品中靶蛋白的含量，进而对检测的样品进行定性/相对定量的统计分析。
试验所需自备物品：
1：酶标仪(450nm波长滤光片)
2：高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3：37℃恒温箱
4：双蒸水或去离子水
样品收集方法：
1：血清：全血样品于室温放置1小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20分钟，取上清即可检测。
2：血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于2-8℃，1000×g离心15分钟，取上清即可检测。
3：组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1 g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10分钟，取上清检测。
4：细胞提取液：贴壁 细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每106个细胞中加入150-200 μL PBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。
将提取液于2-8℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。
5：细胞培养上清或其他生物体液：收集液体后于2-8℃，1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
Rat VEZCadherin/CD144 ELISA Kit样品注意事项：
1：收集血液的试管应为一次性无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品。
2：样品收集后在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。
3：试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或者过低，请对样本做适当的稀释或者浓缩。
4：若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。
5：若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
6：某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。
样本稀释方案：
请提前预估样本的浓度范围，如果您的检测样本需要稀释，参考稀释方案如下：
稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL通用稀释液内，做100倍稀释；
稀释1000倍： 两步稀释。取5μL样本到95μL通用稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL通用稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；
稀释100000倍：
三步稀释。取5μL样本到195μL通用稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL通用稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL通用稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；每步稀释时取液量不少于3 μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。
检测前准备工作:
1：提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(18-25℃)。如果试剂盒需分多次使用，请仅取出本次实验所需的酶标板条和试剂，剩余板条和试剂需按照指定条件保存。
2：洗涤液配置：用蒸馏水1:20稀释（例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水）。
3：标准品配制：取7支 EP 管，分别标注S1,S2,S3,S4,S5,S6，blank,每管中加入 500μL 1×标准品及样品稀释液,从试剂盒标准品管中吸取 500μL 移至第一管S1中，混匀后吸取500ul移至第二管S2中，如此反复作对倍稀释，从第六管S6中吸出500ul弃去，第七管为空白对照。标准曲线浓度为: 4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml。
4：生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。
5：SP复合物工作液配置:使用前20分钟，用SP复合物稀释液将100×SP复合物稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。
6：如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)。
操作步骤：
1：加样：空白孔加入50μl 1×标准品/样品稀释液，其余孔各加入标准品或待测样品50ul，将反应板混匀后置37℃，50分钟。
2：洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次，每孔加入1×洗液350μl，每次震荡/浸泡1-2分钟，向滤纸上印干。
3：空白孔加入100ul生物素化抗体稀释液，其余孔各加入1×的生物素化抗体工作液100ul，混匀后置37℃，40分钟。
4：洗板：同上。
5：每孔加入SABC复合物工作液100ul，混匀后置37℃，30分钟。
6：洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤5次，每孔加入1×洗液350μl，每次震荡/浸泡1-2分钟，向滤纸上印干。
7：每孔加入TMB显色液90ul，混匀后置37 ℃暗处反应10-25分钟（具体显色时间根据显色结果而定）。
8：每孔加入100ul终止液，混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。每孔加入100ul终止液，混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
Rat VEZCadherin/CD144 ELISA Kit声明：
1：限于现有条件及科学技术水平，尚不能对所有原料进行全面的鉴定分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。
2：最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境等因素密切相关，本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本可能的使用量，预留充足的样本。
3：为了达到好的实验结果，请只使用本公司试剂盒内提供的试剂，不要混用其他制造商的产品，严格按照说明书操作。
4：由于操作过程中试剂制备以及酶标仪参数设置不正确，可能导致结果异常，实验前请仔细阅读说明书并调整好仪器。
5：即使是相同人员操作也可能在两次独立实验中得到不同的结果，为保证结果的重现性，需要控制实验过程中每一步的操作。
6：试剂盒发货前会经过严格的质检，然而，因为运输条件、实验设备差异等等因素影响，用户检测结果可能跟出厂数据不一致。不同批次间试剂盒间的差异也可能来自上述原因。
7：本试剂盒未与其他厂家同类试剂盒或不同方法检测同一目的物的产品进行对比，所以不排除检测结果不一致的情况。
8：试剂盒仅供研究使用，如将其用于临床诊断或任何其他用途，我公司将不对因此产生的问题负责，亦不承担任何法律责任。
