硝基呋喃类药物是人工合成的光谱抗生素，有非常好的抗菌作用，曾被广泛应用于水产、禽类等的药物和促生产的饲料添加剂。但近来的科学研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢物可以使实验动物发生癌症和基因突变，因此中国、欧盟、WHO等众多国家和组织禁止食用动物中使用硝基呋喃。硝基呋喃类药物进入动物体内后很快转为代谢物，常用检测呋喃妥因残留的方法是测定代谢产物AHD和邻硝基苯甲醛的衍生物（NP-AHD）。
本酶联免疫检测试剂盒可以经济、快速地检测动物组织（肌肉、肝脏）、蜂蜜等样品中的呋喃妥因代谢物的残留量。
检测原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中呋喃妥因和微孔条上预包被的偶联抗原竞争呋喃妥因抗体，加入酶标二抗后，形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物。随后结合的酶催化TMB底物显色，样本吸光值与其含有的呋喃妥因成负相关。通过标准曲线可准确定量样品中呋喃妥因的含量。通过标准曲线计算所得值乘以样品处理的稀释倍数即为实际样品中呋喃妥因的含量。
间接竞争法模式图
按操作顺序形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物后，加入TMB 底物，板孔液体由无色变成蓝色，再加入终止液液体变为黄色后进行吸光度值测定。
检测实验的局限性
仅供科研使用。
试剂盒的使用期限不得超过试剂盒标签上的有效期。不要将试剂与其他批次或来源的试剂混合使用或替换使用。
如果样品产生的值高于最高标准，则用测定稀释剂进一步稀释样品，并重复测定。稀释剂、操作人员、移液技术、洗涤技术、培养时间或温度以及试剂盒使用年限的任何变化都可能导致结合变化。
样本采集、处理和存储的变化可能会导致样本值的差异。
本试剂盒实验设计消除了不同样品中可能潜在的干扰因素的影响，但并不能涵盖所有潜在影响因素。不能排除存在其他干扰的可能性。
操作要点
为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。
当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。
显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。
应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。蓝色的孔表示终止液未与溶液充分混合。
需要的其他材料
仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹仪、恒温箱、恒温水浴锅、移液枪
试剂：氢氧化钠、磷酸氢二钾、乙酸乙酯、浓HCL、正己烷、二硝基苯甲醛
样品预处理
样本前处理需配液：
1. 1mol/L盐酸溶液：量取8.6mL浓盐酸，加蒸馏水定容至100mL。
2. 衍生化试剂：称取0.15g二硝基苯甲醛，加甲醇100mL溶解，4℃避光保存。
3. 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液：称22.8g磷酸氢二钾，加蒸馏水溶解，定容至1000mL。
4. 1mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0 g氢氧化钠，加蒸馏水定容至100mL。
下面列出的样品收集和储存条件旨在作为一般性指导。样品稳定性尚未评估。
1.鱼虾和肉样样本
（1）称取均质后的组织样本1±0.05g于50mL离心管中，依次加入4ml的蒸馏水，0.5mL 1mol/L HCL溶液和100µL衍生化试剂，充分振荡3min。
（2）置于60℃水浴锅中孵育1h（注意避光）。
（3）取出后依次加入5mL 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，0.4ml 1mol/L 氢氧化钠溶液和6mL乙酸乙酯，充分混匀1min，4000r/min离心10min（如出现乳化现象或乙酸乙酯层不足3mL，需混匀后提高转速和延长离心时间重复离心）。
（4）移取上层溶液3mL于5ml离心管中，置于60℃氮吹仪中进行吹干。
（5）吹干后加入2mL正己烷，涡旋震荡1min，再加入1mL PBST缓冲液，充分混匀后于4000r/min离心10min；去除上层正己烷相（如出现乳化现象，则重复离心）
（6）取50µL下层用于分析。
样品稀释倍数：2倍
2.蜂蜜样本
（1）称取均质后的组织样本2±0.05g于50mL离心管中，依次加入4ml的蒸馏水，0.5mL 1mol/L HCL溶液和100µL衍生化试剂，充分振荡3min。
（2）置于60℃水浴锅中孵育1h（注意避光）。
（3）取出后依次加入5mL 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，0.4ml 1mol/L 氢氧化钠溶液和6mL乙酸乙酯，充分混匀1min，4000r/min离心10min（如出现乳化现象或乙酸乙酯层不足3mL，需混匀后提高转速和延长离心时间重复离心）。
（4）移取上层溶液3mL于5ml离心管中，置于60℃氮吹仪中进行吹干。
（5）吹干后加入2mL正己烷，涡旋震荡1min，再加入1mL PBST缓冲液，充分混匀后于4000r/min离心10min；去除上层正己烷相（如出现乳化现象，则重复离心）
（6）取50µL下层用于分析。
样品稀释倍数：1倍
此方法与呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物试剂盒可合一处理。
试剂准备
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配制：如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配制：试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先将1000ppb标准品（200µL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至8.1ppb（例：8.1µL的标准品母液+991.9µL的1×稀释液，制备得到1000μL的8.1ppb浓度标准品），随后在6个试管中分别加入400μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将8.1ppb标准品依次3倍倍比稀释至7个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为：8.1ppb、2.7ppb、0.9ppb、0.3ppb、0.1ppb、0.03ppb、0.01ppb，从最高浓度标准品溶液中吸取200μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ppb)。
一抗工作液配制：使用前10分钟，用1×稀释液将100×一抗工作液稀释成1×一抗工作液，根据所需用量配置。
酶标二抗工作液配制：使用前10分钟，用1×稀释液将100×酶标二抗稀释成1×酶标抗体工作液，根据所需用量配置。
备注：如样本中待测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数 (建议：将待测样本用样品稀释液最低稀释1倍，在正式实验之前做预实验，以确定具体稀释倍数) ；标准品母液及100×酶标二抗溶液根据实验所需酶标板孔数吸取一定量配制工作液，剩余溶液应放回-20℃储存，且避免反复冻融。
实验步骤
所有标准品、样品建议复孔检测
1. 样本孵育：每孔分别加入50μL不同浓度的标准品/预处理过的待测样品，同时加入一抗试剂50µL/孔（加一抗试剂时请使用多道移液器），盖上封板膜在37℃下孵育30分钟。孵育结束后，每孔加入300μL 1×洗涤缓冲液，轻轻晃动30秒，甩干并在纸上拍干，以这种方式清洗3次。
2. 二抗孵育：每孔加入100μL酶标抗体工作液，轻轻混匀，盖上封板膜在37℃下避光孵育30分钟。孵育结束后，重复步骤1中的清洗方式清洗4次。
3. 底物显色：每孔首先加入50μL显色液A，随后加入50μL显色液B，轻轻混匀，盖上封板膜在37℃下避光孵育15分钟。（加显色液时请使用多道移液器，根据样品和对照抗体的颜色，自行控制显色时间）
4. 终止反应：待显色反应结束后，每孔加入50μL终止液（加终止液时请使用多道移液器），轻轻混匀，5分钟内用预热完成的酶标仪在450nm处测吸光值。
实验步骤汇总
1. 加标准品/样品和一抗，37℃反应30分钟，洗涤3次。
2. 加酶标二抗，37℃反应30分钟，洗涤4次。
3. 加显色液，37℃避光反应15分钟。
4. 加终止液，在5分钟内读数。
结果的计算
以浓度的对数为横坐标，OD值为纵坐标，绘出四参数逻辑函数的标准曲线。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。
若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
精密度
批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。
批内变异系数 CV%小于10%。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。
批间变异系数 CV%小于15%。
回收率
样本回收率：80%-120%
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.01 ppb。
线性关系
校准品剂量反应曲线相关系数 r 值，大于等于 0.9990。
交叉反应性
呋喃妥因：100%
注意事项
1. 此试剂盒提供的终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。
2. 该试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。
3. 显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。
4. 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品。处理后彻底洗手。
